Mercredi 2 juillet 2008

L'électrophorèse

Histoire:

L'origine de cette technique a été imaginée par S.E. Linder et H. Picton en 1892. Ils se sont inspirés des études de Hermann Von Helmholtz menées sur l'électro-osmose. Celui-ci constate qu'il est possible, sous un champ électrique, de déplacer des particules chargées vers le pôle de signe opposé à leur charge.

En 1937, Arne Wilhelm Kaurin Tiselius, met au point la première électrophorèse: l'électrophorèse libre. Cette technique lui a permis de séparer les protéines du serum sanguin en appliquant un champ électrique. La solution est placée dans un tube en U de section carrée afin de réaliser des mesures optiques au travers du tube.
Il a pu ainsi obtenir sur le pôle + des protéines de charge très négative comme l'abumine et sur le pôle - des protéines de charge plus positive comme les globulines.
Cette technique ne permet toutefois pas de séparer totalement les protéines. Il est néanmoins possible de mettre en évidence les frontières formées par des méthodes optiques comme la fluorescence, l'absorption des UV ou l'indice de réfraction.

En 1939, P. König et D Von Klobusitzky ont séparé avec succès les composants du venin de serpent en élaborant la technique d'électrophorèse sur papier.

En 1952, Pierre Grabar élabore, en collaboration avec C.A. Williams, une méthode connue sous le nom d'analyse immuno-électrophorétique, qui permet d'analyser de manière précise des mélanges très complexes d'antigènes. Dès la première application de cette méthode à l'analyse du sérum sanguin humain, il parvient à déceler dans le sérum plus de 30 constituants indépendants, alors que l'électrophorèse en veine liquide ou sur papier ne permettait d'isoler que 5 ou 6 groupes de protéines. La méthode est rapidement utilisée dans de nombreux laboratoires médicaux pour des besoins de diagnostiques.

En 1955, O. Smithies met au point la technique d'électrophorèse en gel d'amidon.

En 1957, Joachim Kohn sépare les différents phénotypes de l'hémoglobines en élaborant la technique d'électrophorèse sur membrane d'acétate de cellulose.

En 1969, Beber et Osborn introduisent l'agent dénaturant SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) pour séparer les différentes sous-unités protéiques.

Principe:

L'électrophorèse est une technique permettant de déplacer des ions (molécules ayant perdu leur neutralité électrique) sous l'effet d'un champ électrique. Ceux-ci migrent vers leur électrode respective: les anions (chargés négativement) migrent vers l'anode (potentiel positif) et les cations (chargés positivement) migrent vers la cathode (potentiel négatif). En ce qui concerne les molécules non chargées, il n'existe pas de migration. Du fait de leurs caractéristiques propres et des conditions de l'électrophorèse, la vitesse de migration et la distance parcourue dans la matrice par ces ions différent. Cela permet ainsi de les séparer.

Avantages:

L'électrophorèse permet de traiter simultanément plusieurs échantillons en même temps.
La séparation est fine.

On peut déterminer 2 types d'électrophorèses:

L'électrophorèse dite "libre" en veine liquide (mise au point par Tisélius en 1937).
L'électrophorèse de zone sur support.

L'électrophorèse en veine liquide.

La migration dans ce type d'électrophorèse s'effectue au sein d'un liquide de composition déterminée soumis à un champ électrique de courant continu (cf. Histoire).

Avantage:

Permet une bonne détermination des mobilités électrophorétiques.

Inconvénients:

Appareillage couteux.
La mise en oeuvre et longue et délicate.
Les particules ne se séparent pas complètement mais il se forme des frontières mise en évidence par des méthodes optiques telles que l'absoption ultra-violette pour les protéines.

L'électrophorèse de zone.

Ce type d'électrophorèse utilise un support poreux pour stabiliser la phase liquide. Le support doit être homogène, poreux et inerte. Différents types de support peuvent être utilisés:
Support en papier ou acétate (la migration des mélanges s'effectue à la surface de celui-ci).
Support en polyacrylamide ou agarose (la migration des mélanges s'effectue à l'intérieur même du support).

Avantages:

Les fractions séparées migrent comme des "zones" individuelles.
La taille des mailles ("pores") pour les supports en gel peut influencer la vitesse de migration (ralentir le déplacement des grosses molécules).

2 types de montage peuvent être mis en place:

Montage horizontal:

Utilisé pour les supports en acétate de cellulose ou en en papier. Le support se présente sous forme de longue et étroite bande.
Les extrémités du support plongent dans un tampon d'électrode, créant une mince couche d'eau à sa surface.

Montage vertical:

Utilisé pour les supports en gel polyacrylamide ou, plus rarement d'agarose . Le gel est souvent préparé peu avant usage en le coulant entre 2 plaques de verre. Durant la gélification on aura pris soin de faire des puits où on déposera les échantillons. Chaque extrémité du gel est mis en contact avec un tampon contenant des électrolytes qui permettra la propagation d'un courant dans le gel.

Electrophorèse sur gel de polyacrylamide ou PAGE (Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis):

Cette technique est très utilisée en immunologie et dans l'étude des protéines car elle permet, après la séparation des différentes protéines, leur transfert sur une membrane de nitrocellulose ou de polyfluorure de vinylidène afin d'être identifier par le biais d'anticorps spécifiques.

Cette technique est également utilisée pour le séquençage de l'ADN (les méthodes traditionnelles de Maxam et Gilbert ou de Sanger permettent de séquencer à la paire de bases près).

La matrice de cette électrophorèse:
Le gel de polyacrylamide est constitué d'acrylamide (extrêmement neurotoxique par ingestion ou contact avec la peau) qui est l'unité de base et de bisacrylamide qui est l'agent portant. En faisant varier les taux de ces 2 substances on obtient différents maillages et donc différentes densités de gel.
La polymérisation est réalisée grace à l'ajout de 2 réactifs: le TEMED (N,N,N',N' tetraméthylènediamine) et l'ammonium persulfate qui deviennent des anions hyperactifs en présence de lumière.

La densité typique d'un gel de séparation peut être à 6%; 8%; 10%; 12% ou 15%.
Plus le gel est dense meilleure sera la séparation des protéines.
Des niveaux de densité plus faibles du gel permettent de séparer des protéines de poids moléculaires proches.

La densité d'un gel de concentration (stacking gel) est à 5%. Ce gel est coulé en haut du gel de séparation. Il permet à l'échantillon une entrée homogène dans le gel de séparation. On utilise un "peigne" afin de créer des "puits" individuels pouvant accueillir chaque échantillon.

par Magniez frédérick publié dans : biotechnologies
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Mardi 8 avril 2008

La technique ELISA

Principe:

La technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) est une technique immuno-enzymatique de détection qui permet de visualiser une réaction antigène-anticorps grâce à une réaction colorée produite par l'action sur un substrat d'une enzyme préalablement fixée à l'anticorps.

Avantages de la technique:

L'utilisation d'anticorps monoclonaux rend la détection spécifique.
Possibilité de quantifier grâce à la réalisation d'une gamme en parallèle.
L'utilisation d'anticorps secondaires rend la technique sensible.
technique accessible à tous les biologistes.
La détection du signal ne nécessite pas la présence d'appareillage spécialisé.
La validité des trousses est d'environ 1 an.

Inconvénients de la technique:

La limite de détection est moins bonne que la technique RIA.
La réaction enzymatique rend cette technique dépendante de la température, du pH et de l'éclairement.

Le test ELISA indirect:

Ce test permet de détecter ou doser des anticorps.
il se réalise en 4 étapes:

La première étape appelée "coating" de l'antigène:
Elle consiste à incuber dans des puits, la solution d'antigène spécifique de l'anticorps recherché. La fixation de l'antigène sur le fond des puits se fait électrostatiquement. Les plaques sont incubées à 4°C pendant une nuit. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les antigènes en excès avec du tampon de lavage.

La deuxième étape consiste à fixer l'anticorps à doser:
On incube à 37°C dans les puits, la solution d'anticorps à doser pendant environ 30 minutes à 2 heures. Les anticorps se fixent spécifiquement sur l'antigène. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps à doser en excès avec du tampon de lavage.

La troisième étape consiste à fixer l'anticorps de détection:
On incube à 37°C dans les puits, la solution d'anticorps de détection pendant environ 30 minutes à 2 heures. Les anticorps de détection se fixent spécifiquement sur les anticorps à doser. Les puits sont ensuite lavés pour éliminer les anticorps de détection en excès avec du tampon de lavage. Notons que les anticorps de détection sont couplés à une enzyme qui en présence de son substrat le transforme en produit de réaction détectable et mesurable grace à l'apparition d'une coloration.

La quatrième étape consiste à révéler les anticorps fixés:
On incube à température ambiante et à l'obscurité pendant 10 minutes, une solution révélatrice contenant le substrat pour l'enzyme. L'apparition d'une coloration dans le substrat indique la présence de l'anticorps à doser. L'intensité de celle-ci est proportionnelle à la quantité d'enzyme présent et donc à la concentration d'anticorps recherché.

Exemple d'application:
Identification dans le sérum du patient, les anticorps anti-protéines de l'enveloppe et du corps du virus de l'immunodéficience humaine.

Le DAS ELISA direct ou Double Antibody Sandwich ELISA direct:
Dans ce cas de figure, l'antigène se trouve entre 2 anticorps spécifiques. L'utilisation de la DAS ELISA nécessite de posséder 2 anticorps monoclonaux reconnaissant des épitopes différents sur l'antigène.

La première étape consiste à fixer sur le support, l'anticorps de capture. On incube la solution à 37°C pendant 2 heures puis lavage ou une nuit à 4°C puis lavage.

Lors de la deuxième étape, on dépose l'échantillon possédant l'antigène à identifier qu'on laisse incuber à 37°C pendant 2 heures puis lavage ou une nuit à 4°C puis lavage.

Dans une troisième étape, on fixe l'anticorps de détection marqué avec une enzyme sur l'antigène recherché. Pour cela, on dépose la solution d'anticorps dans les puits puis on incube l'ensemble à 37°C pendant 2 heures.

La dernière étape, on dépose une solution révélatrice contenant le substrat pour l'enzyme et on laisse incuber pendant 30 à 120 minutes. Le produit de réaction obtenu est soluble et coloré. L'intensité de cette coloration peut être mesurée à l'aide d'un photomètre.
NB: la différence entre le DAS ELISA direct et le DAS ELISA indirect par le système biotine-streptavidine réside au niveau de l'anticorps de détection. Pour le DAS ELISA indirect par le système biotine-streptavidine, l'anticorps de détection porte une molécule de biotine qui interragie avec la streptavidine couplé à une enzyme.

La sensibilité du test DAS-ELISA direct se situe entre 1 et 10 ng/ml. Cette sensibilité peut être augmentée par l'utilisation du système indirect du fait de la forte affinité entre la streptavidine et la biotine.

par Magniez frédérick publié dans : biotechnologies
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Mardi 11 mars 2008

Les anticorps monoclonaux

Définition:

Les anticorps monoclonaux ou monoclonal antibody sont identiques car produits par un clone de cellules spécialisées du système immunitaire (les plamocytes). Les anticorps monoclonaux sont très largement utilisés en biologie et en médecine, à la fois comme outils de diagnostic et dans des buts thérapeutiques.

La production de ces anticorps in-vitro est très difficile à cause de la faible durée de vie des plasmocytes.

In-vivo, la production de ces anticorps peut être obtenue en injectant chez l'animal un antigène donné puis extraction de ceux-ci dans le sang. Cette méthode est très couteuse et très peu d'anticorps sont obtenus.

L'élaboration de la technique des hybridomes par César Milstein et Georges köhler en 1975 a permis d'obtenir une grande quantité d'anticorps à faible coût et ainsi permettre de les utiliser dans de nombreuses applications.

Cette technique consiste à injecter l'antigène d'intérêt chez une souris puis de prélèver, au bout de quelques semaines, les cellules de la rate. Parmis ces cellules se trouvent des plasmocytes sécrétant des anticorps dirigés spécifiquement contre l'antigène choisi. On fusionne ces plasmocytes avec des cellules de tumeur appelées cellules myélomateuses (cellules immortelles) grâce à l'addition de polyéthylène glycol (PEG) qui induit la fusion membranaire et permet ainsi d'obtenir des hybridomes qui ont la capacité de se multiplier plus rapidement que les cellules normales du corps productrices d'anticorps et de développer indéfiniment des anticorps spécifiques. Les cellules sont ensuite réparties dans des plaques multipuits de telle sorte qu'il n'y ait qu'une cellule par puits. Afin d'éliminer les plasmocytes et les cellules myélomateuses non fusionnées, on utilisera un milieu de culture sélectif (milieu de culture HAT). Les plasmocytes non fusionnés meurent rapidement et les cellules myélomateuses utilisées ayant un gène non fonctionnel pour une enzyme intervenant dans la synthèse des nucléotides-hypoxanthine - guanine - phosphoribosyl - transférase (HGRPT) sont incapable de survivre dans un milieu HAT (hypoxanthine aminoptérine thymidine).
Seules les cellules hybrides se multiplient. Au bout d'une dizaine de jours, on recherche dans chaque puits la présence d'anticorps dirigés contre l'antigène utilisé pour immuniser la souris. On repique les cellules productrices. On isole ainsi quelques clones cellulaires producteurs qui pourront être conservées dans l'azote liquide.

Exemples d'application:

Test d'ovulation: les anticorps monoclonaux anti-hormone lutéinisante qui révèlent l'augmentation du taux d'hormone LH (signe précurseur de l'ovulation).

Test de grossesse: le principe repose sur la détection de l'hormone hCG (human chorionic hormon) dans les urines par le biais d'une réaction colorée spécifique grâce à l'utilisation d'anticorps monoclonaux anti-hCG.

Fabrication des anticorps monoclonaux contre des antigènes portés par des cellules tumorales afin de les détruire. L'intérêt de l'utilisation des anticorps monoclonaux pour un traitement anti-cancereux réside dans la spécificité de ceux-ci à détruire des cellules cibles. On peut soit utiliser des anticorps seuls (anticorps nus) qui en s'attachant à la cellule entraînent sa mort ou associés à une autre molécule comme une toxine ou un produit radioactif. L'anticorps sert dans ce cas là, à amener vers la cellule tumorale l'élèment qui va la détruire.

Test ELISA: utilisation des anticorps monoclonaux comme anticorps traceurs dans le test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Ce type de test est utilisé notamment dans le dépistage de la séropositivité au virus VIH, c'est à dire pour mettre en évidence la présence d'anticorps anti-VIH dans le sérum.

Inconvénient :
Comme la plupart des anticorps monoclonaux sont produits dans des cellules de rongeurs, on peut observer une réaction immunitaire lors de leur injection chez un patient. Cette imunité inactive progressivement l'action bénéfique de l'anticorps monoclonal. Pour remédier à ce problème, on produit des anticorps "chimériques" ou "humanisés".

Les anticorps "chimériques" sont obtenus par greffage des parties constantes d'immunoglobuline humaine sur les parties variables d'un anticorps de souris.
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les anticorps “humanisés” sont produits par fermentation microbienne ou par des souris transgéniques contenant seulement une partie des gènes humains à l'origine des Anticorps. Ils sont potentiellement mieux tolérés dans l'organisme humain.

par Magniez frédérick publié dans : biotechnologies
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Lundi 25 février 2008

La PCR

Présentation de la PCR:

cette technique fut imaginée par le scientifique américain Karry Bank Mullis et développée par le Dr H.A. Herlich avec la collaboration de la compagnie Cetus en 1985.

La PCR ou Polymérase Chain Reaction conduit à l'amplification in-vitro de plusieurs millions de fois une séquence spécifique d'acide nucléique qui peut être minoritaire voir très rare (10^-2pg). Elle exploite le processus de la réplication et fait appel, pour cela, sur la capacité de l'ADN polymérase à synthétiser le brin complémentaire d'un ADN servant de matrice. Pour initier le processus, des amorces (ou primer) s'hybrident de part et d'autre de la séquence à amplifier. Cette configuration permet à l'ADN polymérase de répliquer les 2 monobrins dans le sens 5' vers 3' et ainsi aboutir à la synthèse de nouveaux ADN doubles brins.

La PCR s'effectue sur 3 étapes:

La dénaturation thermique de l'ADN: à 95°C, les liaisons d'hydrogènes sont rompues et les 2 brins de l'ADN se séparent. L'ADN passe sous forme simple brin dans le milieu.
Hybridation des amorces: le milieu réactionnel contient 2 amorces, chacune complémentaire d'un des 2 brins. La température permettant la fixation des amorces sur les monobrins d'ADN est comprise entre 50°C et 65°C. Les amorces en larges excès, s'hybrident dès lors qu'elles rencontrent les séquences complémentaires.
Extention des amorces: intervention de la taq polymérase (ADN polymérase) qui allonge les amorces en y incorporant les désoxyribonucléiques complémentaires de la séquence de la matrice auquel elle est hybridée. Cette étape s'effectue à une température de 72°C.

Au deuxième cycle: la quantité d'ADN continue de doubler et les premiers brins dont la taille est limitée par les 2 amorces font leur apparition.
Au troisième cycle: Les premiers amplicons apparaissent (ADN double brins borné par les amorces correspondant au fragment d'ADN recherché).

En théorie, après n cycles, on augmente le nombre d'ADN interressant de 2ⁿ.
En pratique, le nombre de brins est limité à cause de la baisse de certains réactifs, l'augmentation de la viscosité du milieu et la baisse de l'activité de l'ADN polymérase thermostable.
A l'issue de la PCR, on obtient des fragments de même taille correspondant à la distance en base qui sépare les amorces.

La technique PCR se réalise par le biais d'un appareil programmable appelé un thermocycleur dans lequel sont placés les microtubes contenant le mélange réactionnel. Cet appareil permet d'exposer les tubes à des températures choisies et pour des durées déterminées par l'expérimentateur. La réaction PCR est extrêmement rapide, elle ne dure que quelques heures (2 à 3 heures pour une PCR de 30 cycles).

Composition du mélange réactionnel dans les microtubes:

Le mélange s'effectuera toujours sur la glace et les différents élèments qui le compose seront placés dans l'ordre suivant dans les microtubes:
H_²0, le tampon, MgCl₂, les nucléotides, les amorces, l'enzyme ( taq polymérase) et enfin l'ADN à amplifier.
NB: on réalise toujours un témoin dans lequel l'ADN est remplacé par de l'eau (témoin négatif) afin de déceler une éventuelle contamination (la contamination par de l'ADN précédemment amplifié représente le principal risque). Un témoin positif permettra de valider la bonne conservation des réactifs, de l'enzyme responsable de la polymération et des performances du thermocycleur. un témoin interne présent dans le milieu réactionnel renseignera sur la présence ou l'absence d'inhibiteurs de l'amplification.

Révélation des produits d'amplification:

Lorsque la quantité de produits d'amplification est suffisante, ceux-ci sont soumis à une électrophorèse en gel d'agarose. Cette électrophorèse permet de faire migrer les acides nucléiques au travers du gel additionné de BEt (Bromure d'éthydium: produit intercalant qui se glisse entre les bases des acides nucléiques faisant apparaitre à la molécule d'ADN une fluorescence orange sous illumination par des UV courts (environ 30 nm)). La vitesse de migration étant dépendant de la masse de la molécule, donc du nombre de bases de l'ADN testé, la présence et la taille des amplicons peuvent être facilement vérifiable sur le gel.

Intérêts de la technique PCR:

La PCR peut être un outil très avantageux dans la détection de génes mutés responsables de cancers et de maladies génétiques.
Elle peut également être très utile pour le suivi des thérapies anticancéreuses et ainsi permettre au médecin de poursuivre ou pas le traitement.
Comme certains cancers sont induits par translocation chromosomique, la PCR identifie la présence ou pas de réarengements chromosomiques avec une sensibilité plus importante par rapport à d'autres techniques (elle peut ainsi détecter une cellule cancéreuse pour un million de cellules normales).
La PCR peut servir dans la détection d'infection virale ou bactérienne. Elle est utilisée dans l'identification du virus du SIDA.
La PCR peut intervenir dans l'étude concernant l'évolution des espèces. La divergence des espèces à partir d'un ancêtre commun est reflétée par le degré de divergence entre les séquences nucléotidiques des génes. La mesure de cette divergence nucléotidique peut être utilisée pour déterminer le lien de parenté entre différentes espèces.

par Magniez frédérick publié dans : biotechnologies
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Lundi 18 février 2008

Identification bactérienne par la coloration de GRAM

La coloration de Gram doit son nom au bactériologiste danois Hans Christian Gram qui mis au point le protocole en 1884.
Les bactéries présentent toutes une paroi constituée d'une substance, la muréine qui est un peptidoglycanne. Celle-ci est recouverte par une membrane externe chez les bactéries Gram-, tandis que les bactéries à Gram+ en sont dépourvues. Cette paroi de part son organisation permet de les classer soit dans les Gram+ ou les Gram-. Cette information est importante car elle est utilisée dans la taxonomie. Elle permet ainsi, avec la reconnaissance de la morphologique et le mode de groupement des bactéries de renseigner sur l'ordre dont fait partie les bactéries étudiées.

Cette coloration de Gram se réalise en 7 étapes:

1 On réalise un frottis sur une lame de microscope à partir d'une suspension bactérienne: on agite la suspension afin de l'homogénéiser et d'éviter d'avoir un culot au fond du tube. Avec l'aide d'une anse que l'on aura préalablement stérilisé (en la passant sous le bec benzène), on prélève un peu de la solution bactérienne en plongeant le fil de platine de la anse dans le tube à essai.

2 On dépose ensuite ce prélèvement au milieu de la lame en faisant des rotations jusqu'à séchage.

3 On procède à la fixation du frottis soit avec de l'éthanol à 90° (5 minutes) puis on enflamme la lame ou on passe directement 3 fois la lame dans la flamme du bec benzène.

4 La coloration au violet de Gentiane (colorant basique): la lame est plongée pendant 2 à 3 minutes (en fonction de la concentration) dans la coloration au violet de gentiane. Toutes les bactéries sont colorées en violet puis rincer à l'eau déminéralisée.

5 Mordançage au lugol (solution iodo-iodurée) : étaler le lugol et laisser agir 20 secondes ; Rincer à l'eau déminéralisée. Cette étape permet de stabiliser la coloration violette.

6 Décoloration à l'alcool: verser goutte à goutte l'alcool sur la lame inclinée obliquement. Surveiller la décoloration (5 à 10 secondes). Le filet doit être clair à la fin de la décoloration. Rincer sous un filet d'eau déminéralisée. L'alcool pénettre dans la bactérie. La coloration au violet de Gentiane disparait. Les bactéries décolorées sont des bactéries Gram-. Si l'alcool ne traverse pas la paroi, on est en présence de bactéries Gram+.

7 Contre coloration avec de la Fuchsine ou de la Safranine: laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Laver doucement à l'eau déminéralisée. Sécher la lame sur une platine chauffante à 40°C, 10 à 15 minutes. Les bactéries Gram- sont colorées en rose.

Exemples:

Les bactéries à Gram+:
Les Staphylocoques apparaissent en "grappe de raisin" violette.
les Streptocoques sous la forme d'une chainette violette.

Les bactéries à Gram-:
Echérichia coli (enterobactérie) apparait sous la forme de bacille rose.

Pourquoi les bactéries à Gram- ne restent-elles pas colorées en violet après la décoloration à l'alcool comme les bactéries à gram+?

La paroi des bactéries Gram+ est composée d'une 40ène de couche de peptidoglycanne ne permettant pas à l'alcool de traverser cette paroi épaisse tandis que la paroi des bactéries à Gram- n'est formée que d'une seule couche de peptidoglycanne.

par Magniez frédérick publié dans : biotechnologies
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Mercredi 6 février 2008

La culture cellulaire

Définitions:

On appelle culture d'organe, le maintien en dehors de l'organisme, d'organes ayant conservé leur structure et leur fonction (coeur perfusé).

On appelle culture de tissu, le maintien en dehors de l'organisme, des tissus de manière à conserver les fonctions spécifiques de chaque tissu.

On appelle culture cellulaire, le maintien en dehors de l'organisme, des cellules non organisées en tissu mais capable de se diviser in-vitro et d'exprimer des métabolismes et des fonctions spécifiques.
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http://www.flickr.com/photos/72271358@N00/34322005/
photos de alysson @!@
cellule humaine en mitose

Histoire:

3 périodes vont marquer le développement de la culture cellulaire.

La période des précurseurs (1885, 1900). Cette période annonce la première méthode de culture de tissu en dehors du corps, grace au Professeur Ross Harrison qui a pu cultiver des neuroblastes de grenouille dans un milieu de lymphe et ainsi franchit un premier pas vers la recherche actuelle sur les cellules souches et dérivées.

La période de la culture de tissus (à partir de 1902). Cette période est dominée par Alexis Carrel qui oriente le développement de la culture de tissus suivant 3 voies principales:

L'amélioration des techniques d'obtention des tissus.
L'élaboration des règles d'aseptie.
L'étude des besoins nutritionnels.

La culture cellulaire n'apparait proprement dit qu'à partir de 1952 lors de l'introduction de la trypsinisation des tissus par Moscona en 1952. Il procéde à la digestion de tissu d'oeuf de poulet avec de la trypsine afin d'obtenir des cellules isolées ou des amas de cellules capables de se diviser in-vitro.

Les techniques d'obtention des cellules:

On distingue 2 types de cellules:

Les cellules libres et circulantes comme les cellules du sang
Les cellules en cohésion les unes avec les autres, constituant un tissu.

Les techniques d'obtention de ces 2 classes de cellules sont différentes.

Les cellules circulantes sont obtenues par prélèvement et centrifugation.
Les cellules organisées en tissus nécessitent la mise en oeuvre de techniques plus originales qui peuvent être divisées en 2 groupes: la méthode par dissection et la méthode par digestion enzymatique.

La méthode par dissection:

Cette méthode est la plus ancienne. Elle a permis aux précurseurs de la culture de tissu d'obtenir les premières cellules in-vitro.

La méthode de Carrel consiste à prélever un morceau de tissu qui est réduit en un très petit rectangle et déposé à la surface d'un mélange de 2 gouttes de plasma de coq et de 2 gouttes d'extrait embryonnaire à 50%. Après un séjour de 24H à l'étuve, on voit migrer les premières cellules à partir de l'explant.

La méthode de dissection consiste à couper en fragment d'environ 1 à 4 mm3 le tissu que l'on réduit encore à l'aide de pince. Ces fragments sont ensuite placés dans un flacon de culture contenant un milieu nutritif. Les cellules vont migrer à partir des différents fragments puis se multiplier. Cette méthode s'appelle également la méthode des explants.

La méthode Jensen:
Cette technique est plus rarement utilisée.
Les fragments de tissus de 1 mm3 sont placés sur un disque de papier filtre qui repose sur un support métallique dans une boite de pétri . Les cellules qui prolifèrent à partir du fragment du tissu traversent les pores du papier et se fixent au fond de la boite. Cette technique donne l'avantage d'une séparation constante entre l'explant et les cellules migrantes évitant l'étape délicate de l'élimination de l'explant lorsque une couche subconfluente est obtenue.

La méthode mécanique:
Cette technique s'applique pour des tissus mous comme le thymus, la rate. Elle consiste à frotter le tissu sur une grille puis de filtrer et centrifuger. On peut également dilacérer les tissus à l'aide d'une pipette en verre en pipetant et refoulant les tissus.

La méthode par digestion enzymatique:

Les enzymes utilisées sont des enzymes protéolytiques qui digèrent la trame protéique qui entoure les cellules. on utilise souvent la trypsine à une concentration de 0,5 à 2,5 g/l dans une solution saline.

Les avantages et les inconvénients de ces méthodes.

La méthode par dissection est souvent utilisé quand le tissu à mettre en culture est très petit. L'obtention nécessaire pour avoir des couches cellulaires confluentes est relativement long (environ 30 jours).
La méthode enzymatique est beaucoup plus rapide avec un bon rendement mais certaines cellules à membrane fragile peuvent être lésées par cette méthode.

Les méthodes de culture:

La culture stationnaire ou monocouche:

Le principe général de cette méthode est lié à l'affinité des cellules au support car la plupart appartient à des tissus solides organisés.
Le support peut être du verre ou du plastique traité pour la culture. Le plastique peut être recouvert de support physiologique: collagène, fibronectine ou d'une membrane basale reconstituée ou encore l'utilisation de gèle d'agarose, de géle de collagène pour une orientation vers la culture 3D. undefined

Les cellules sont placées dans des boites micropuits de diamétres différents ou sur des microporteurs (microbilles en plastique) recouverts ou non de support physiologique. Les microporteurs sont ensuite placés dans des récipients puis soumis à une agitation modérée et continue permettant aux cellules de demeurer dans le milieu de culture. Le rendement de cette technique est importante. Cela étant dû à une surface d'adhérence plus grande.

La culture en suspension:

Comme la plupart des cellules ont besoin d'un support pour croître, il faut donc trouver un artifice pour maintenir la plupart de celles-ci en suspension.
En 1933, Monsieur Gey arrive à faire croître dans des tubes en verres, des cellules en suspension tournant à grande vitesse.

L'agitation peut être réalisée par différents moyens:

Elle peut être entretenue par des barreaux magnétiques siliconés appelés "SPINNER"
Il existe également des appareils d'agitation perfectionnés appelés des cytoculteurs qui permettent de maintenir une densité cellulaire,un environnement gazeux constant ainsi qu'un apport continu de milieux frais et la récupération de milieux usés.

Contrôles fonctionnels des cellules en culture:
Deux caractéristiques sont à considérer:

La prolifération des cellules.
La préservation des fonctions spécialisées.

Selon que l'on débute une culture ou qu'on est en culture de routine, les paramétres de contrôle différent.

Les contrôles réalisés lors de la mise en route d'une culture:

On vérifie les conditions s'aseptie lors de la dissection et augmente la dose d'antibiotique et fongique si nécessaire.
On vérifie l'état des cellules recueillies par le bleu de trypan.
Le bleu de trypan est un colorant qui a tendance à entrer dans les cellules qu'il rencontre. Une fois dans la cellule, la molécule en question entraîne un mécanisme d’exclusion qui va éjecter cette molécule dans le milieu extérieur. Ce mécanisme nécessitant de l’énergie, seules les cellules possédant une source d’ATP peuvent le mettre en place. Ainsi, une cellule vivante expulsera la molécule et restera blanche au microscope, au contraire une cellule morte n’aura pas les moyens de la rejeter et restera bleue. Cependant, cette molécule étant toxique, elle finit par tuer les cellules qui deviennent alors toutes bleues.
On vérifie la morphologie des cellules au microscope et la présence d'un marqueur biochimique spécifique du type cellulaire.

Les contrôles de routine:

Vérifier la morphologie des cellules au microscope ainsi que l'adhérence de celles-ci. Le manque d'adhérence peut dévoiler l'absence de place pour la croissance des cellules, l'inadéquation du support, un milieu "usé". Le remplacement du milieu s'effectue tous les 2 à 3 jours. Le milieu doit être neutre ( pH 7,2 à 7,4). Inférieur à 6,5 la viabilité des cellules est menacée. Il est donc important d'utiliser un indicateur pour vérifier l'acidité du milieu comme le rouge de phénol dont le pH à l'équivalence se situe dans sa zone de virage (entre 6,6 et 8,4). En dessous de 6,6 le rouge de phénol vire au jaune.

Les techniques d'entretien:

En ce qui concerne les cellules adhérentes, le changement du milieu usé s'effectue par aspiration.
Les cellules en suspension sont tant qu'à eux, soumis à une centrifugation à 800 jets.
Lorsque la population cellulaire est confluente, on rince le milieu avec une solution EBSS (solutions salines équilibrées de earle) et on utilise de la trypsine afin de détacher les cellules cultivées sur boîte de Pétri pour ensuite les repartir sur d'autre flacon.

La conservation des cellules est indispensable pour les cellules à durée de vie limitée et pour les cellules difficiles à entretenir. Elle se fait par cryoconservation.
La conservation de longue durée se réalise dans de l'azote liquide à -180°C. Les cellules sont placées en présence de DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), de FCS à 10% et de DMSO (diméthyle sulfoxide) à 10% ou de glycérol (Le DMSO et le glycérol sont des agents cryoprotecteurs) dans des tubes de congélation de 1ml. La concentration des cellules doit être de 10 milliards de cellules par ml.
La conservation de court durée se réalise à -20°C.
La décongélation des cellules se fait de manière rapide, en plaçant celles-ci sous une ampoule dégageant une température de 37°C.

L'évolution des cellules en culture:

Les cellules in-vitro présentent 2 propriétés fondamentales qui sont: la capacité proliférative et leur fonction différentiée.
Ces propriétés ont tendance à évoluer de manière très différentes quelle que soit la méthode de culture employée. Les cellules conservent la plupart du temps leur potentiel de division, pouvant être stimulé au début de la culture par des facteurs de croissances. Même si au cours du temps, on peut noter un ralentissement de celui-ci. A l'inverse, les cellules en culture voient souvent leur fonction différentiée se modifier et même disparaître. Ce phénomène de dédifférentiation peut être visible morphologiquement.
Notons que certains types cellulaires révèlent leur fonction spécifique que lorsqu'ils sont cultivés en vie ralentie. Pour cela, on procéde à un appauvrissement progressif du milieu ou on utilise une substance inhibitrice de la division cellulaire.

par Magniez frédérick publié dans : biotechnologies
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Mercredi 12 septembre 2007

la microbiologie en agro-alimentaire

La microbiologie et ces applications dans les industries agroalimentaires.

Les techniques de culture:

L'intérêt des biotechnologies dans les industries agro-alimentaires est d'obtenir des métabolites utiles, des molécules qui ont un intérêt industriel à partir de matériel biologique. l'obtention de ces molécules se réalisent en 2 étapes:

La production du produit interessant appelé fermenteur:

La production se fait à partir de procédés de fermentation. ils sont constamment développés afin de cultiver les micro organismes dans les conditions optimales pour qu'ils puissent produire les produits désirés.

La récupération du produit formé:

L'extraction et la purification du produit doivent être réalisées par des techniques douces comme l'electrophorèse, la distillation ou la chromatographie.

Les différents systèmes de fermentation:

Il existe 3 grands systèmes de fermentation.

Le premier système de fermentation appelé fermentation batch ou discontinue:

le fermenteur est un système clos, fermé. Au temps zéro de la fermentation, la solution de nutriment stérile est inoculée avec des micro organismes (bactéries, levures). l'incubation se réalise dans des conditions d'agitation, de température, de pression partiel en oxygène et de régulation de PH. Au cours de l'incubation, la quantité de micro organismes dans le fermenteur, la concentration en biomasse, en substrat et en produit varie constamment, conséquence du métabolisme microbien.
On peut observer 4 phases de croissances:
une phase de latence
une phase exponentielle de croissance
une phase stationnaire
une phase de mortalitée

Le deuxième système de fermentation appelé fermentation fed bath ou bath alimenté:

le substrat est apporté au fur et à mesure de sa consommation par les microorganismes. Ce système est employé dans la production de la penicilline. En effet,celle-ci est soumise à une répression catabolique lors de la présence d'une forte concentration de substrat carboné (le glucose). On procéde à l'ajout du substrat au fur et à mesure de sa consommation afin d'éviter l'accumulation de substrat dans la réaction.

Le troisième système de fermentation appelé fermentation continue ou sytème ouvert:

La solution de nutriment est apportée en continue au réacteur mais une quantité équivalente de solution fermentée est prélevée. Le volume est donc constant.

On distingue 2 grands types de fermenteurs continus:
Le réacteur à écoulement piston
Le réacteur infinment mélangé

ces 2 types de fermenteurs différent par le mode découlement de la solution de nutriment.

Le réacteur à écoulement piston:
il est caractérisé par un rapport longueur /largeur très élevé. Le réacteur est cylindrique (10 à 15 mètres de long). La solution de nutriment pénettre à une extrémité du réacteur et la biomasse cellulaire ainsi que la production du produit collecté à l'autre extrémité du réacteur. Dans ce type de réacteur la turbulence est nulle. Il n'y a aucun mélange, pas d'agitation, pas d'homogénéité. un élèment qui entre dans le réacteur progresse sans mélange avec la molécule qui la précède ou qui la suit. Ceci génère des gradients de concentration à l'intérieur du réacteur. Plus on se situe loin par rapport à l'entré du réacteur, plus la concentration de substrat est faible et plus la concentration du procuit est élevée. L'inconvénient dun tel type de réacteur est la difficulté de réguler un PH. Celui-ci étant différent en tout point du réacteur.

Le réacteur infiniment mélangé:
l'homogénéité du continu du réacteur est parfaite.
Tout élèment qui pénettre dans le réacteur est homogénéisé au contenu du réacteur.
La concentration d'un composé donné dans le réacteur est le même en tout point du réacteur.
La concentration d'un composé donné dans l'éffluent du réacteur est la même qu'à la concentration de ce composé à l'intérieur du réacteur.

par Magniez frédérick publié dans : biotechnologies
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Mardi 10 juillet 2007

microbiologie

La microbiologie et ces applications en biotechnologie.

Histoire:

l'observation des microbes n'a pu se faire qu'a partir d'une avancée technique importante : le MICROSCOPE. En 1680 Anton Van Leeuwenhoeck inventa le premier microscope optique lui permettant les premières observations (avec un grossissement de 100 fois environ) des micro-organismes , appelés à l'époque "animalcules". Jusqu'en 1857, les scientifiques croyaient que les "animalcules" provenaient de la transformation spontanée de la matière organique.

Louis Pasteur réfute l'idée de la génération spontanée. Il appuie sa théorie en prenant comme expérience la transformation du lait, des céréales et jus de fruit. Cette transformation n'est possible que par un ensemencement naturel venant de l'extérieur. Et ces organismes microscopiques seront appelés les ferments. Il utilisera pour cela un récipient clos contenant la solution qu'il portera à ébullition afin de détruire tous les microorganismes présents dans celle-ci.

Les micro-organismes des usines à tout faire:

La manipulation de la potentialité naturelle des bactéries afin de les améliorer soit métaboliquement en modifiant leur milieu naturel soit génétiquement en modifiant le génome.

Ecoli incubated at 50 degrees
(http://www.flickr.com/photos/mooneyes/514363259/)

En 1985: transformation bactérienne possédant le gène humain de l'insuline.

En 1986 :fabrication de l'interféron par des bactéries (fabriqué dans l'organisme à faible dose, il agit à fort dose contre certain cancer).

En 1987 premier vaccin recombinant: la réalisation de ce vaccin consiste à injecter le gène qui code pour l'épitope de la virulence provenant d'une batérie pathogène à une bactérie non pathogène et de l'administrer à l'organisme qui devant sa présence, synthétisera l'anticorps correspondant à cette bactérie pathogène. Un épitope est un déterminant antigénique, c'est à dire une partie d'une molécule reconnue comme étrangère par le système immunitaire... Si un antigène est une protéine par exemple, l'épitope sera la séquence de quelques acides aminés reconnue comme étrangère.

En 1989: synthèse de l'érythropoïétine par génie génétique (hormone qui provoque l'augmentation de globules rouges dans le sang).

La microbiologie et ses applications en génie génétique:

l'objectif du génie génétique:

Le génie génétique est un ensemble de techniques, issues de la biotechnologie, ayant pour objet la modification des génotypes, et donc des phénotypes, par transgénèse. Cette manipulation permet aux cellules receveuses d'acquérir de nouvelles propriétés provenant d'une espèce différente. il consiste à transférer un gène d'une espèce à une autre.

Une des étapes importantes dans le transfert de gène consiste à obtenir des clones c'est à dire isoler et multiplier le gène d'intérêt. Cette étape necessite l'utilisation de bactéries afin d'en assurer leurs transformations, c'est à dire à l'introduction de fragments d'ADN dans celles-ci par l'intermédiaire de vecteurs de clonage. Les vecteurs sont des petits ADN dans lesquels on insère un fragment d'ADN que l'on veut étudier. Ces petits ADN sont généralement des plasmides ou des bactériophages. Pour assurer cette transformation, le choix de la souche bactérienne est très importante: Les bactéries ne doivent pas être hermétique à l'introduction de vecteurs de clonage. Elles doivent posséder une mutation pour le gène qui code pour une protéase.

La transformation des bactéries peut se faire par 2 méthodes :

Les bactéries et les vecteurs de clonage sont plongées dans une solution de chlorure de calcium. Ce sel de calcium agit sur la paroi des bactéries en créant des orifices. On fait subir dans le même temps un choc thermique en plaçant l'ensemble sur de la glace afin de permettre au plasmide d'entrer en contact avec la paroi puis un retour à une température de 37°C afin d'assurer l'introdution de celui-ci dans la bactérie.

La technique d'électroporation consiste à placer les bactéries en solution à des impulsions électriques provoquant des pores à travers la paroi et ainsi permettre l'entrée des plasmides.

Exemple d'utilisation de bactéries transformées en vue d'une utilisation médicale:

Une collaboration de l'équipe de Michel Guérineau de l'Institut de Génétique et de Microbiologie (CNRS-université Paris 11) et la société Rhône-Poulenc-Rorer, dans le cadre du programme Bioavenir, ont abouti en 1997 à la construction d'une souche bactérienne génétiquement modifiée de Streptomyces pristinaespiralis produisant un antibiotique, la pristinamycine. La pristinamycine produit normalement par la bactérie est constituée d'un mélange de 2 composants: la pristinamycine I et la pristinamycine II. Cette dernière est elle-même un mélange de 2 molécules: la PIIA qui est le produit final de la voie de biosynthèse et la PIIB qui est le précurseur de la PIIA. Cependant la souche naturelle était incapable d'assurer la bioconversation totale de PIIB vers PIIA, d'ou la necessité de transformer cette souche par génie génétique en y introduisant les gènes codant pour la PIIA synthétase. Les souches possédant ce gène pourront ainsi fabriquer l'enzyme qui assurera la bioconversion de PIIB en PIIA.

Exemple: la modification génétique des bactéries lactiques en vue de leurs utilisations dans la transformation alimentaire.

Même si à ce jour, il n'y a pas encore de bactéries lactiques transgéniques autorisées dans les aliments, leurs utilisations pourraient apporter des solutions à de nombreux problèmes que rencontre les industries agroalimentaires lors des procédés de fabrications. Ces bactéries pourraient être une réponse aux attaques de bactériophages (virus s'attaquant au bactéries) qui peuvent mettre en echec la fermentation et ainsi diminuer la qualité du produit voir même, si la contamination est importante, détruire la production. On peut bien imaginer les conséquences économiques et sanitaire que cela peut engendrer. Les bactéries lactiques produisent une grande variété de peptides ou de protéines ayant une activité antibactérienne. Ces molécules appelées bactériocines peuvent être une solution dans la sécurité hygiènique de certains fromages. l'utilisation de souches transgéniques deviendraient encore plus efficaces car plus spécifiques vis-à-vis des bactéries cibles. La modification de la structure des bactériocines permettraient également de les rendre moins sensibles aux milieux. La forme sauvage étant moins efficaces dans le fromage que la forme modifiée. L'obtention reproductible du produit est rendu plus difficile d'une part par l'utilisation d'une matière première "comme le lait" très variable en ses élèments imfluançant l'efficacité du système métabolique des bactéries et d'autre part, les souches sauvages présentent une instabilité génétique en particulier pour les caractères impliqués dans l'utilisation de leur source d'énergie glucidique ou des fractions azotées impliquées dans la synthèse de leurs protéines. Modifier génétiquement la régulation des systèmes métaboliques de ces souches permettrait de les rendre moins dépendant de ces variations de milieux de cultures et génétiques.

Exemple: l'utilisation des microorganismes transgéniques en vue d'une application environnementale et industrielle.

La présence de matières toxiques ou dangereuses conduit au développement de certaines bactéries qui les utilisent dans leur métabolisme qui les convertit en produits inoffensifs. Cette observation a amené certains chercheurs à les utiliser pour décontaminer des zones polluées. Ce procédé, appelé la biorestauration, fût expérimenté lors du naufrage du pétrolier Exxon Valdez en 1989 le long des côtes d'Alaska. Actuellement des études sont menées pour perfectionner cette technique en utilisant des bactéries transgéniques, notamment par des groupes de chercheurs en Microbiologie environnementale et Bioingénierie environnementale de l'IRB-CNRC et l'Institut Française du pétrole dont leur étude repose sur l'utilisation de bactéries transgéniques capablent de dégrader le méthyl-tertiobutyl éther (MTBE) dans les eaux souterraines. le MTBE est un additif de l'essence qui contribue à réduire les émissions de monoxyde de carbone et d'hydrocarbures imbrulés. En raison de sa grande solubilité dans l'eau et de la fréquence élevée des déversements, le MTBE contamine de nombreux aquifères.Un groupe de gènes permettant au Mycobacterium austroafricanum d'utiliser le MTBE comme seule source de carbone à pu être isolé et cloné dans une bactérie hétérologue (Mycobacterium smegmatis) afin de confirmer leur rôle.

par Magniez frédérick publié dans : biotechnologies
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Mercredi 31 janvier 2007

OGM

Définition:

Un OGM désigne un organisme vivant dont le patrimoine génétique a été modifié par l'introduction d'un ou plusieurs gènes étrangers à son espèces. Cette manipulation génétique, effectuée en laboratoire porte le nom de trangénèse. Tous les êtres vivants sont concernés : bactéries, virus, plantes et animaux. Cette modification à pour intérêt d'apporter un ou plusieurs caractères que ne possédés pas l'espèce. (En terme scientifique, les caractères d'un individu sont appelés des phénotypes).

par Magniez publié dans : biotechnologies
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Jeudi 25 janvier 2007

Les biotechnologies végétales pour quoi faire?

Les biotechnologies végétales pour quoi faire?

L'introduction et l'utilisation des biotechnologies végétales sont étroitement liées à l'évolution de l'amélioration des plantes en tant que science.

Les objectifs de la sélection variétale sont:

Plus de productivité; plus de résistances aux maladies et aux pathogènes; Meilleures adaptations aux sols et aux climats; Meilleures adaptations aux techniques culturales; régularité de productivité et de forme; meilleures qualités culinaires et adaptation aux process de transformation industrielle.

La sélection classique:

La création de nouvelles variétés végétales possédant un ou de nouveaux caractères nécessite la maîtrise de la reproduction sexuée par des croisements contrôlés (en veillant à distinguer les plantes allogames; autogames ou hermaphrodites), les étapes successives de sélection (méthode de sélection généalogique ou pédigree) ainsi les recombinaisons génétiques (crossing-over) qui ont lieu lors des croisements

les plantes allogames sont des plantes qui préfèrent être pollinisées par un pollen différent .Les Plantes autogames préfèrent le mariage avec eux-même.

La sélection classique par le fait qu'elle repose entièrement sur processus de reproduction sexuée des plantes présente certaines limites qui peuvent être surmontées par les biotechnologies notamment la difficulté de réaliser des croisements interspécifiques entre espèces ainsi que le risque d'introduire lors de la sélection des caractères indésirables.Les biotechnologies permettent de dépasser la barrière de l'espèce mais également de maîtriser avec précision le ou les gènes nouvellement introduits et ceci par l'utilisation d'une technique couramment utilisée qui est la PCR (polymérase chain reaction).

La création d'une nouvelle variété étant directement liée au cycle de végétation et au nombre de génération successive, nécessite un délai très important avant d'être mis sur le marché.L'usage des biotechnologies réduit considérablement ce délai.

Biotechnologies végétales:

Les biotechnologies peuvent intervenir à plusieurs niveaux dans la plante:

Au niveau cellulaire par l'utilisation des techniques d'hybridation somatique,d'haplodiploïdisation, multiplication in vitro etc... ( certaines de ces techniques seront traitées ultérieurement)
- L'utilisation des biotechnologies cellulaires est étroitement liée aux propriétés de la cellule végétale qui sont:
  - la plasticité des cellules végétales ( adaptation rapide aux variations de l'environnement).
  - La totipotence des cellules (aptitude à la dédifférenciation ) qui permet aux cellules végétales prélevées sur un organe quelconque d'une plante et mise en culture in vitro de régénérer un individu complet et identique à la plante mêre.
Au niveau moléculaire par la création d'une carte génétique, l'identification des gènes d'intérêts par le biais de sondes moléculaires.
Hybridation des plantes par l'outil des biotechnologies appelé également la transgénèse.

Les biotechnologies cellulaires:

Les biotechnologies cellulaires permettent d'exploiter la diversité génétique existante de l'espèce et entre les espèces et d'introduction cette diversité par mutagénèse; la technique de sauvetage d'embryon interspécifique; la fusion de protoplates et la variation somaclonale.

Principe de la technique du Sauvetage d'embryon interspécifique:

Si on croise une espèce sauvage de tomate avec une espèce cultivée de tomate, l'embryon issu de cette fécondation va avorter à cause de l'absence d'appariement des chromosomes lors de la prophase I de la méïose (synapsis). Pour éviter cette avortement, l'embryon immature sera prélevè et mise en culture dans une boite de pétri afin d'assurer la régénération d'un nouvel individu possèdant les caractèristiques des 2 espèces.

Principe de la technique d'hybridation somatique:

L'hybridation somatique consiste à fusionner des protoplastes de cellules (cellules végétales dont la paroi a été hydrolysée) d'espèces apparentées afin d'obtenir des plantes génétiquement transformée possèdant de nouveaux caractères agronomiques.

En théorie, la fusion permet d’obtenir toutes les combinaisons. Dans la réalité, de nombreuses régulations ont lieu au moment de la première mitose, rendant impossibles certaines combinaisons. De plus, ce n’est pas parce qu’il y a fusion qu’il y a addition des noyaux et des cytoplasmes. Il se produit des éliminations de matériel, dont les mécanismes sont inconnus.

Avec l’hybridation sexuée, entre deux espèces végétales voisines, deux compartiments génétiques ne seront pas exprimés dans l’hybride : les plastes et les mitochondries, qui sont hérités par la mère. Avec l’hybridation somatique, en fusionnant deux protoplastes d’espèces différentes, plus ou moins proches, les deux cytoplasmes peuvent s’exprimer dans la cellule obtenue, c'est-à-dire confronter les génomes chloroplastiques et mitochondriaux. Une variation génétique inaccessible par les voies classiques est alors disponible. Or de nombreuses résistances(comme la résistance aux herbicides) sont d’origine chloroplastique ou mitochondriale, donc difficilement transférables par les voies classiques. A l’aide de l’hybridation somatique, des résistances contenues dans les espèces sauvages ont pu être introduites dans une souche cultivée.

Principe de la technique d'haplodiploïdisation:

L'haplodiploïdisation consiste à obtenir des plantes à partir des gamètes mâles (microspores) ou des gamêtes femelles (sac embryonnaire). La technique utilisant les gamètes mâles porte le nom d'androgenèse, celle utilisant les gamètes femelle porte le nom de gynogenèse.

Après extraction des microspores polliniques , ceux-ci sont placés en culture in vitro afin de favoriser la multiplication cellulaire et la différenciation de celle-ci. La plante obtenue est haploïde c'est à dire qu'elle possède qu'un seul exemplaire de chromosome. Il faut alors procéder à la duplication du nombre de chromosomes par l'utilisation de colchicine (alcaloïde très toxique). A l'issue de ces différentes étapes, on obtient une lignées pures.

Cette technique à un grand avantage pour les selectionneurs. Elle permet de fixer les caractères d'une espèce durablement et de manière très rapide. Si on compare le temps qu'il faut entre le moment où l'on réalise le premier croisement de départ et la 2ième année d'inscription, il faudra 9 à 10 ans pour créer une variété par le cycle de sélection classique et 6 à 7 ans par le cycle de sélection avec haplodipoïdisation. Il n'est pas nécessaire de procéder à des cycles d'autofécondations répétitifs comme dans la sélection généalogique.

Les biotechnologies moléculaires:

Les sociétés semencières se dirigent vers cette technique, afin d'étudier le polymorphisme des espèces végétales. Cette technique fait appel à des marqueurs moléculaires. Elle a pour avantage de distinguer deux individus très proches dont l'étude phénotypique classique ne le permet pas.Le polymorphisme est identifié sur la base de mutations neutres au niveau des séquences nucléotidiques ou de séquences spécifiques d'individus phénotypiquement identique.

Les marqueurs moléculaire peuvent être de 2 types:

Marqueurs biochimiques: ils correspondent à des formes différentes d'une même proteines (allèles/isozymes).

Marqueurs moléculaires: Ils correspondent à des régions du génome ou les séquences d'ADN sont polymorphes. Ces séquences peuvent correspondre à des séquences codantes ( régions transcrites en ARN et traduites en proteines) ou non codantes (régions régulatrices de la transcriptions).

Quelques précautions sont à prendre dans le choix des marqueurs moléculaires:

ils doivent être pluriallélique c'est à dire qu'ils possédent de nombreux alléles permettant de caractériser différents individus. Ces alléles me doivent pas avoir d'effet phénotypique . Les marqueurs doivent être codominants permettant ainsi de distinguer des individus hétérozygotes de ceux qui sont homozygotes car ils présentent silmultanément les caractères des deux parents. Ils doivent être également indépendant des conditions de culture.

Exemple d'un marqueur moléculaire RFLD (restriction fragment lingth polymorphism) et la technique southern blot:

Le marqueur RFLD permet de mettre en évidence un polymorphisme allélique correspondant à des mutations fonctionnelles neutres sur l'ADN et donc indécelable au niveau phénotypique. Ces mutations neutres peuvent être des additions, délétions ou substitutions de fragments d'ADN.

Ces mutations vont affecter des régions d'ADN appelées sites de restrictions (Les sites de restriction sont des séquences particulières de nucléotides qui sont reconnues par les enzymes de restriction comme des sites de coupures dans la molécule d'ADN) et ainsi modifier les profils de restrictions après l'analyse southern blot.

Principe de la technique southern blot: